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1 裂解细胞
2 质粒DNA与染色体DNA的分离
3 纯化
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小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定
1 材料和方法
1.1 实验动物 Balb-c小鼠，6周龄, 雌性, 购自北京大学医学院实验动物部。
1.2 质粒、菌株、细胞株和主要试剂 质粒pEGFP-N1、pGEM-T载体质粒、E coli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293细胞株（本元正阳）。AdMaxTM Kit E试剂盒（Microbix Biosystems，Inc.）。Taq酶、T4 DNA连接酶（Takara公司）。限制性核酸内切酶XmaⅠ、Bgl II、Hind III（Biolabs）。Trizol 试剂、Lipofectamine 2000（Invitrogen）。逆转录试剂盒、PCR Master Mix（MBI）。质粒提取、胶纯化试剂盒（QIAGEN）。DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因测序由北京诺塞基因研究中心有限公司完成。
1.3 构建小鼠CD40Ig基因真核表达质粒
1.3.1 小鼠脾脏总RNA的提取：将小鼠以颈椎脱臼法处死，取出脾脏，加入液氮研磨后，用Trizol试剂提取总RNA，方法按产品说明进行。
1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制备：以小鼠脾脏总RNA为模板，oligo-dT为引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA为模板，用CD40和mIgG Fc特异引物进行PCR扩增，另以pEGFP-N1质粒为模板进行PCR扩增，引物及PCR反应条件见表1，分别获得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。
1.3.3 质粒pGEM-IgG的构建：将IgG Fc的PCR产物与pGEM-T质粒进行TA连接反应，即10μl PCR产物加2μl的pGEM-T载体加10 U的T4连接酶，16 ℃过夜。取2μl的连接产物以氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，用蓝白斑方法挑选含氨苄青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml LB培养基（含氨苄青霉素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振荡培养过夜，提取质粒pGEM-IgG并测序。
1.3.4 质粒p516-IgG的构建：用Bgl II分别消化pGEM-IgG和pDC516，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行胶纯化。将IgG片段和pDC516线性载体按7:1的摩尔浓度比例加T4连接酶16 ℃过夜进行连接反应。取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，用pDC516-f和mIgG-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），将PCR阳性的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。
1.3.5 质粒p516-CD40-IgG融合基因的构建：用Xma I分别消化CD40的PCR产物和p516-IgG，将CD40片段和pDC516-IgG 线性载体进行连接（方法同上）。转化大肠杆菌DH5α后，用pDC516-f和CD40-r引物组合进行菌落PCR筛选（见表2），将阳性结果的重组子进行细菌培养，提取质粒并测序。
1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP质粒的构建：用Hind Ⅲ分别消化GFP的PCR产物和pDC516-CD40-IgG，将GFP片段和pDC516-CD-IgG 线性载体进行连接反应（方法同上），用GFP-f和pDC516-r引物组合进行菌落PCR筛选正向插入的重组子（见表2），提取质粒并测序。
1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP质粒的大量制备：按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification试剂盒说明进行制备，产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实（见图2），紫外分光光度仪测OD值，过滤除菌后-20 ℃保存备用。
1.3.8 重组质粒转染293细胞：在6孔板中将2.0×105个细胞接种于2 ml含血清不含抗生素的DMEM中，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，使细胞在转染时铺满平板的60%～70%。用Lipofectamine 2000转染试剂介导重组质粒转染，在无菌EP管中准备A、B两种溶液。A液：将4.0μg DNA溶于250μl无血清DMEM中，轻轻混匀；B液：将10μl Lipofectamine 2 000溶于250μl无血清培养液中，轻轻混匀，室温孵育5 min。将A液和B液混合并混匀，室温孵育20 min，以形成脂质体/DNA复合物。换去6孔板中旧的培养液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM，逐滴加入500μl脂质体/DNA复合物。在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后换液。
2 结果
2.1 获得小鼠CD40胞外区、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r经PCR扩增的小鼠CD40胞外区基因片段为572 bp；引物mIgG-f和mIgG-r经PCR扩增的小鼠IgG2a Fc段为700 bp；引物GFP-f和GFP-r经PCR扩增的GFP基因片段为765 bp。琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表达质粒的成功构建
2.2.1 pDC516-IgG的构建：pGEM-T载体为3 000 bp的质粒，构建的pGEM-IgG质粒为3 700 bp。pGEM-T质粒的多克隆位点上游110 bp处含有T7 Primer序列，用T7+mIgG-r引物组合可扩增出约810 bp的片段，用T7 primer测序证实IgG序列的正确性。将IgG片段和pDC516线性载体进行连接反应，用pDC516-f测序证实IgG插入序列的正确性（见图3）。
2.2.2 pDC516-CD40-IgG的构建：将CD40片段和pDC516-IgG线性载体进行连接反应，用引物pDC516-f测序证实CD40插入序列的正确性。
2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP质粒的构建：将GFP片段和pDC516-CD40-IgG 线性载体进行连接反应，用pDC516-r测序证实GFP插入序列的正确性。CD40-IgG-GFP含酶切位点的融合产物为2001bp，编码667aa（见图4）。
2.3 重组质粒在真核细胞内表达 pDC516-CD40-IgG-GFP质粒抽提后在紫外分光光度计下检测到OD值为0.1257。将该质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞的第4天开始可见零星的细胞上有GFP表达，随着时间的延长，GFP表达的细胞量逐渐增多，第7天左右在荧光显微镜下见大量的细胞有绿色荧光发生（见图5）。
参考资料：http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html
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