正陽黴素
1. 正陽飼料廠家多少錢一包
重要飼料廠的有多少錢一包的都有。
2. 正陽到汝南拉綠通能通行嗎
可以同行的 運蔬菜水果的可以同行不受限
3. 汝州到正陽暢通嗎
現在很多高速都已封堵,為了安全起見。不要到處亂跑
4. 馬上就復工了,正陽縣現在還禁止機動車上路嗎
想去廣東的方法有很多具體情況你啊,你要去好好的說。
5. 真核生物(如小鼠)的質粒如何提取,請寫下詳細步驟,謝謝
對於小鼠來說,質粒只存在於線粒體中
質粒提取可分為三個部分
1 裂解細胞
2 質粒DNA與染色體DNA的分離
3 純化
這里找到一篇論文:
小鼠CD40Ig基因真核表達質粒的構建及鑒定
1 材料和方法
1.1 實驗動物 Balb-c小鼠,6周齡, 雌性, 購自北京大學醫學院實驗動物部。
1.2 質粒、菌株、細胞株和主要試劑 質粒pEGFP-N1、pGEM-T載體質粒、E coli.DH5a(天根公司)。低代次HEK293細胞株(本元正陽)。AdMaxTM Kit E試劑盒(Microbix Biosystems,Inc.)。Taq酶、T4 DNA連接酶(Takara公司)。限制性核酸內切酶XmaⅠ、Bgl II、Hind III(Biolabs)。Trizol 試劑、Lipofectamine 2000(Invitrogen)。逆轉錄試劑盒、PCR Master Mix(MBI)。質粒提取、膠純化試劑盒(QIAGEN)。DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰酶(Gibco)。引物合成由上海生工公司完成,基因測序由北京諾塞基因研究中心有限公司完成。
1.3 構建小鼠CD40Ig基因真核表達質粒
1.3.1 小鼠脾臟總RNA的提取:將小鼠以頸椎脫臼法處死,取出脾臟,加入液氮研磨後,用Trizol試劑提取總RNA,方法按產品說明進行。
1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制備:以小鼠脾臟總RNA為模板,oligo-dT為引物,RT-PCR合成cDNA,再以此cDNA為模板,用CD40和mIgG Fc特異引物進行PCR擴增,另以pEGFP-N1質粒為模板進行PCR擴增,引物及PCR反應條件見表1,分別獲得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。
1.3.3 質粒pGEM-IgG的構建:將IgG Fc的PCR產物與pGEM-T質粒進行TA連接反應,即10μl PCR產物加2μl的pGEM-T載體加10 U的T4連接酶,16 ℃過夜。取2μl的連接產物以氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α,用藍白斑方法挑選含氨苄青黴素抗性的白斑克隆,在3 ml LB培養基(含氨苄青黴素100 μg/ml)中37 ℃、80 r/min振盪培養過夜,提取質粒pGEM-IgG並測序。
1.3.4 質粒p516-IgG的構建:用Bgl II分別消化pGEM-IgG和pDC516,產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳後進行膠純化。將IgG片段和pDC516線性載體按7:1的摩爾濃度比例加T4連接酶16 ℃過夜進行連接反應。取5μl連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α,用pDC516-f和mIgG-r引物組合進行菌落PCR篩選正向插入的重組子(見表2),將PCR陽性的重組子進行細菌培養,提取質粒並測序。
1.3.5 質粒p516-CD40-IgG融合基因的構建:用Xma I分別消化CD40的PCR產物和p516-IgG,將CD40片段和pDC516-IgG 線性載體進行連接(方法同上)。轉化大腸桿菌DH5α後,用pDC516-f和CD40-r引物組合進行菌落PCR篩選(見表2),將陽性結果的重組子進行細菌培養,提取質粒並測序。
1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP質粒的構建:用Hind Ⅲ分別消化GFP的PCR產物和pDC516-CD40-IgG,將GFP片段和pDC516-CD-IgG 線性載體進行連接反應(方法同上),用GFP-f和pDC516-r引物組合進行菌落PCR篩選正向插入的重組子(見表2),提取質粒並測序。
1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP質粒的大量制備:按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification試劑盒說明進行制備,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳證實(見圖2),紫外分光光度儀測OD值,過濾除菌後-20 ℃保存備用。
1.3.8 重組質粒轉染293細胞:在6孔板中將2.0×105個細胞接種於2 ml含血清不含抗生素的DMEM中,在5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h,使細胞在轉染時鋪滿平板的60%~70%。用Lipofectamine 2000轉染試劑介導重組質粒轉染,在無菌EP管中准備A、B兩種溶液。A液:將4.0μg DNA溶於250μl無血清DMEM中,輕輕混勻;B液:將10μl Lipofectamine 2 000溶於250μl無血清培養液中,輕輕混勻,室溫孵育5 min。將A液和B液混合並混勻,室溫孵育20 min,以形成脂質體/DNA復合物。換去6孔板中舊的培養液,重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM,逐滴加入500μl脂質體/DNA復合物。在5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h後換液。
2 結果
2.1 獲得小鼠CD40胞外區、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r經PCR擴增的小鼠CD40胞外區基因片段為572 bp;引物mIgG-f和mIgG-r經PCR擴增的小鼠IgG2a Fc段為700 bp;引物GFP-f和GFP-r經PCR擴增的GFP基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。
2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表達質粒的成功構建
2.2.1 pDC516-IgG的構建:pGEM-T載體為3 000 bp的質粒,構建的pGEM-IgG質粒為3 700 bp。pGEM-T質粒的多克隆位點上游110 bp處含有T7 Primer序列,用T7+mIgG-r引物組合可擴增出約810 bp的片段,用T7 primer測序證實IgG序列的正確性。將IgG片段和pDC516線性載體進行連接反應,用pDC516-f測序證實IgG插入序列的正確性(見圖3)。
2.2.2 pDC516-CD40-IgG的構建:將CD40片段和pDC516-IgG線性載體進行連接反應,用引物pDC516-f測序證實CD40插入序列的正確性。
2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP質粒的構建:將GFP片段和pDC516-CD40-IgG 線性載體進行連接反應,用pDC516-r測序證實GFP插入序列的正確性。CD40-IgG-GFP含酶切位點的融合產物為2001bp,編碼667aa(見圖4)。
2.3 重組質粒在真核細胞內表達 pDC516-CD40-IgG-GFP質粒抽提後在紫外分光光度計下檢測到OD值為0.1257。將該質粒用Lipofectamine 2000轉染293細胞的第4天開始可見零星的細胞上有GFP表達,隨著時間的延長,GFP表達的細胞量逐漸增多,第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細胞有綠色熒光發生(見圖5)。
參考資料:http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html
6. 齊齊哈爾正陽醫院皮膚科開的綠葯膏用過的么
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7. 重慶市黔江區正陽火車站派出所服務電話是多少
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8. 正陽縣都賣哪些復合肥
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9. 正陽有多少病例
58例吧要帶好口罩哦
10. 最近有沒有去信陽送貨的車輛,不讓返回正陽嗎
現在車輛大概陸續反饋。